Laporan Mikrobiologi Most Probable Number

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Kuantitasi mikroba menunjukan jumlah koloni yang mampu di bentuk oleh mikroba tertentu. Beberapa koloni bakteri ini, bagi tubuh manusia akan menyebabkan penyakit. Seteril dari bakteri untuk maknan terutama minuman, sangat perlu di ketahui demi menjaga kesehatan. Air minum dari berbagai tempat memepunyai jenis-jenis bakteri yang tidak sama untuk air minum hasil penyulingan diharapkan sudah terbebas dari bakteri (Dwidjoseputro, 1994).

Pertumbuhan sering kali dinyatakan secara singkat sebagai kemampuan untuk menghasilkan 2 sel baru dan hidup. Sel dikatakan hidup bila dapat menghasilkan  sel baru. Bila tidak mempunyai kemampuan ini lagi, Maka sel dinyatakan tidak hidup lagi atau mati. Analisis pertumbuhan bakteri dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu, membandingkan jumlah sel, berat kering, konsentrasi protein atau nitrogen dan kekeruhan (Dwidjoseputro, 1994).

Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa memberikan perlakuann terlebih dahulu, sedangkan jumlah mikroorganisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memeberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain adalah memebuat  preparat dari suatu bahan (preparat sederhana di warnai atau tidak di warnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber), sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan yang masih hidup saja. (Dwidjoseputro, 1994).

Oleh karena itu yang melatar belakangi percobaan ini ialah agar pratikan dapat mengetahui  tentang teknik-teknik perhitungan mikroba dan salah satunya yaitu metode MPN dan mengerti tentang perhitungan mikroba pad prinsip percobaan metode MPN serta hal yang berkaitan dengan bakteri koliform pada percobaan yang dilakukan.

1.2  Tujuan

-        Untuk mengetahui prinsip metode MPN

-        Untuk mengetahui fungsi dari media EMBA, BGLBB, LB

-        Untuk mengetahui proses terjadinya gelembung pada tabung durham di setiap uji percoban MPN

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count) TPC, perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Dwidjoseputro, 1994).

Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun  pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Dwidjoseputro, 1994).

Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fecal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994).

Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli. Karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform jauh lebih cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji penduga yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Dwidjoseputro, 1994).

Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi pangan. Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadannya dalam pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh kotoran manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka perlu dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar aman dikonsumsi. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya bakteri tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu atau lebih tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan kotoran yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat bakteri patogen lain yang berbahaya. Ada tiga jenis bakteri yang dapat digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichia coli, kelompok Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens (Hastowo, 1992).

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Hastowo, 1992).

Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menenetukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan (Hastowo, 1992).

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam praktikum digunakan kelompok Coliform sebagai indikator. Kelompok Coliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik fakultatif, batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Coliform memfermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35°C (Hastowo, 1992).

Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham (Lay, 1992).

Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode MPN. Metode MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang  pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan  gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung reaksi untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah  Lactose Broth  yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki komposisi  Beef  extract  (3 gr),  peptone  (5 gr),  lactose  (10 gr) dan Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr (Lay, 1992).

MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan menggunakan medium padat, tetapi pada metode MPN dengan menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005).

Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran. Cara ini secara luas digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan seperti air, susu, biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat untuk kemudian ditanam dalam medium pembiakan bulyon agar dan setelah inkubasi jumlah koloni dihitung. Setelah dikonversi sesuai dengan pengencerannya, akan diketahui jumlah bakteri per milliliter. Karena pengenceran dikerjakan secara lipat ganda atau secara desimal, maka angka yang diperoleh hanya angka perkiraan, yang biasa disebut Most Probable Number (MPN) (Irianto, 2006).

Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dari probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negative (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan (Dwidjoseputro, 2005).

Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan tabung yang lain mengandung sel sama sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positifm sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo, 2004).

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspense 1:10 dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005).

Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-masing dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif atau tidak ditandai dengan timbulnya kekeruhan  atau gas pada tabung durham. Misalnya pada pengnceran pertama, 3 tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran ke 2 tabung positif, pada pengenceran ke 3 satu tabung positif, dan pada pengenceran teakhir tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3 pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini kemudian dicocokkan dengan table MPN, kemudian nilai MPN sampel dapat dihitung sebagai berikut :

MPN sampel = Nilai MPN dari table x                         1                                                                 Pengenceran tabung tengah

BAB III

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1  Waktu dan Tempat

Pada pratikum mikrobilogi ini berjudul tentang perhitungan jumlah mikroba dengan menggunakan metode MPN yang dilaksanakan pada hari rabu, pada tanggal 20 April 2011 pada pukul 10.00-12.00 WITA dan dilanjutkan pengamatan pada pada hari kamis, pada tanggal 21 April 2011 pada pukul 05.00-06.00 WITA. dan dilanjutkan pengamatan ke dua pada pada hari sabtu, pada tanggal 23 April 2011 pada pukul 08.00-10.00 WITA. Dan di lanjutkan pengamatan ke tiga pada pada hari senin, pada tanggal 25 April 2011 pada pukul 12.00-12.30 WITA. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi  dan Bioteknologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Mulawarman Samarinda.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

-          Botol sampel

-          Rak tabung  reaksi

-          Tabung reaksi

-          Tabung durham

-          Blue tip

-          Mikropipet

-          Bunsen

-          Korek

-          Cawan petri

-          Jarum inokulasi/ose

-          Vortex

-          Pipet volume

-          Inkubator

-          Laminar air flow

-          Autoclave

-          Pensil

-          Almunium foil

-          Penyemprot alkohol

3.2.2 Bahan

-          Lactose Borth (LB)

-          Brilliant Green lactose Bile Broth (BGLBB)

-          Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)

-          Alkohol 70%

-          Garm fisiologi

-          Kertas label

-          Tisu

-          Air galon (minum)

-          Air sungai

-          Air sumur

-          Air PDAM

-          NaCl 45 ml

3.3 Cara kerja

3.3.1 Uji penduga

1.        Disiapkan Alat dan Bahan.

2.        Disiapkan 5 tabung reaksi setiap seri pengenceran yang di pilih.

3.        Dimasukan 5 ml sampel air minum pada setiap tabung reaksi seri pengenceran 10.

4.        Dimasukan 0,5 ml sampel pada seri pengenceran 1 .

5.        Dimasukan 0,5 ml sampel pada larutan NaCl 4,5 ml .

6.        Dimasukan 0,5 ml campuran NaCl tadi pada setiap tabung reaksi seri pengenceran 10^-1.

7.        Dimasukan 0,5 ml larutan NaCl 4,5 ml yang telah dilarutkan sampel pada larutan NaCl 4,5 ml untuk pengenceran 10^-2.

8.        Dimasukan campuran NaCl 4,5 ml tadi pada setiap seri tabung reaksi pengenceran 10^-2.

9.        Diinkubasi dalam suhu 35⁰C selama 24 jam dan sebelumnya diberi label pada setiap pengenceran yang dilakukan.

10.    Diamati perubahan pada tabung reaksi.

11.    Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel.

3.3.2 Uji penegas

1.        Disiapkan alat dan bahan.

2.        Dipijarkan jarum ose dan dimasukan ke dalam tabung reaksi pada uji penduga pada pengenceran 10.

3.        Dimasukan jarum ose pada yang elah dimasukan ke dalam pengenceran 10 ke dalam media BGLBB.

4.        Dipijarkan lagi jarum ose dan di ulangi perlakuan yang sama hingga ke lima tabung reaksi setiap seri pengenceran yang di lakukan.

5.        Diberi label pada setiap seri tabung reaksi pengenceran yang dilakukan.

6.        Diinkubasi pada suhu 35⁰C selama 24 jam.

7.        Diamati gas yang terbentuk pada tabung durham.

8.        Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel.

3.3.3 Uji pelengkap

1.        Disiapkan alat dan bahan.

2.        Dipijarkan jarum ose pada lampu bunsen.

3.        Dimasukan jarum ose pada tabung reaksi pengenceran ke 10.

4.        Digoresakan jarum ose yang telah di masukan padapengenceran 1o pada media EMBA yang terdapat pada cawan petri dan di gunakan pada kolom yang tersedia hingga ke lima seri tabung pengnceran 10.

5.        Dipijarkan lagi jarum osedan di lakukanperlakuan yang sama hingga ke lima tabung  reaksi setiap seri pengenceran yang di lakukan.

6.        Diberi label.

7.        Diinkubasi pada suhu 35⁰C selama 24 jam.

8.        Diamati setiap cawan petri yang terdapat bakteri E.coli.

9.        Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1 Tabel Hasil Pengamatan Metode MPN

Media		Seri	Pengamatan		Nilai MPN	MPN
	10	1	10-1	10-2	Tabel
LB	4	4	3	1	33	3300
GLBB	3	4	1	2	26	2600
EMBA	0	0	0	0	-	-

4.2 Perhitungan

4.2.1 Perhitungan Media LB (lactose Borth)

MPN Count : Nilai MPN Tabel  x                                 10

(pengenceran tabung tengah)

: 33  x  10

10^-1

: 3300  Cfu/100 ml

4.2.2 Perhitungan Media GLBB (green lactose bile borth)

MPN Count : Nilai MPN Tabel  x                                 10

(pengenceran tabung tengah)

: 26  x  10

10^-1

: 2600  Cfu/100 ml

4.2.3 Perhitungan Media EMBA (eosin methylene blue agar)

MPN Count : Nilai MPN Tabel  x                                 10

(pengenceran tabung tengah)

: 0  x  Cfu

100 ml

: 0  Cfu/100 ml

4.3 Pembahasan

Metode MPN (Most Probable Number) adalah metode yang digunakan untuk menghitung koliform di dalam air dengan menggunakan pengujian fermentasi dalam tabung. Tiga pengujian itu diantaranya adalah uji penduga (Presumtive Test), uji penegas (Confirmed Test), dan uji pelengkap (Completed Test)  Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni dalam sampel (Dwidjoseputro, 1994).

Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C (Dwidjoseputro, 1994).

E.coli adalah bakteri koliform yang ada pada kotoran manusia, maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam saluran pencernaan manusia dan merupakan bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya bakteri coliform fecal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994).

Media Lactose broth (LB) digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran coliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonella dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk coliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa (lay, 1992)

Media EMBA (Eosin Methylene Blue Agar) mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti Staphylcoccus. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasikan laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan methylene blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp. dan dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri E.coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan methylene blue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri E.coli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa (Hastowo, 1992).

Media BGBB (Brilliant Green Bile Broth) digunakan untuk mengkonfirmasi hasil tes positif dugaan. Brilliant Green Bile Broth (BGBB) juga disebut sebagai  Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB). Enzimatik Intisari dari Gelatin adalah sumber karbon dan nitrogen digunakan untuk kebutuhan pertumbuhan umum di Brilliant Green lactose Bile Broth. Oxbile dan Brilliant Green menghambat bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif banyak, selain E.coli. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Bakteri yang fermentasi laktosa dan menghasilkan gas yang terdeteksi  Penggunaan utama dari media ini adalah untuk mengidentifikasi keberadaan E.coli pada makanan. Selama inkubasi 24 jam pada suhu 37 °C E.coli akan memfermentasi laktosa dalam kaldu dengan produksi gas dan Gas ini akan terkumpul dalam sebuah tabung durham terbalik (Hastowo, 1992).

Uji Penduga (Presumptive Test) : satu seri yang berisi 9 atau 12 tabung yang berisi Lactose Broth dan tabung durham diinokulasikan dengan sampel air untuk menguji apakah air tersebut mengandung bakteri yang bisa memfermentasikan laktosa yang memproduksi gas. Jika setelah inkubasi gas timbul pada Lactose Broth, diduga ada bakteri coliform di sampel air tersebut.  Uji penduga merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri coliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas yang disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan E.coli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung durham yang berupa gelembung udara. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuknya asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN. dan jika tidak terbentuk gas dalam tabung durham, dihitung sebagai hasil negatif. Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri, MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN (Lay, 1992).

Uji penguat atau pelengkap. Merupakan uji dari tabung yang positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1 x 24 jam, suspensi diinokulasikan pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA) secara aseptik dengan menggunakan jarum inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilap metalik (Lay, 1992).

Uji penegas untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Dari koloni yang berwarna pada uji penguat atau pelengkap. Uji penegas merupakan suatu uji sebelum dilakukanya uji pelengkap dimana digunakn media (BGLBB) Brilliant Green Lactose Bile Broth. Dimana pada media ini di lihat fermentasi laktosapada bakteri E.coli dengan terbentuknya asam dan gelembung. Pada uji penegas banyaknya kandungan bakteri E.coli dilihat dengan menghitung tabung yang terdapat gelembung di dalam tabung durham dan dihitung MON count dengan melihat hasil dari MPN tabel dikali sepuluh per pengenceran tengah dan dari hasil uji penegas akan disimpulkan dengan uji penguat atau pelengkap (Dwidjoseputro, 1994).

Hasil pengamatan pada perhitungan jumlah bakteri dengan menggunakan metode MPN diketahui, pada uji penduga digunkannya media lactose borth dengan sampel air minum yang digunakan diketahui seri pengamatan 10 terdapat empat gelembung, pengenceran 1 terdapat empat gelembung, pengenceran 10^-1 terdapat tiga gelembung, dan pengenceran 10^-2 terdapat satu gelembung. Pada MPN tabel diketahui 33 nilai MPN tabelnya dan dari perhitungan MPN count didapatkan hasi 3300 Cfu /100 ml.

Pada uji penegas dengan menggunakan media Brilliant Green Lactose Bile Broth dapat diketahui seri pengamtannya pada pengenceran 10 terdapat lima gelembunng, pada pengencera 1 terdapat empat gelembung, dan pada pengenceran 10^-1 terdapat satu gelembung sedangkan pada pengenceran 10^-2 terdapat dua gelembung. Dari hasil pengenceran didapatkan hasl nilai MPNtabelnya 26, dengan perhitungan mencari Mpn count hasil yang didapat dari MPN-nya adalah 2600 Cfu/100 ml.

Pada uji penguat atau pelengkap dari setiap seri pengenceran tidak didapatkan hasil adanya bakteri E.coli yang tumbuh pada sempel air minum. Jadi, hasil yang didapat adalah nihil atu tidak ada bakteri E.coli yang tumbuh.

Faktor kesalahan pada percobaan perhitungan jumlah mikroba pada metode MPN. Trejadi pada cara penggoresan pada media EMBA yang tidak sesuai dengan alur dan melewati dari garis pembatas kolom, serta kurang hati-hati dalam melakukan percobaan sehingga terdapat tabung reaksi yang pecah akibat kecerobohan.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari hasil pratikum mengenai “perhitungan jumlah mikroba dengan metode MPN” dapat disimpulka bahwa :

-          Prinsip dari metode MPN adalah suatu metode perhitungan jumlah mikroba yang menggunakn tiga tahap uji yaitu uji penduga , uji penegas/konfirmasi dan uji pelengkap yang didasarkan untuk mengetahui jumlah dari mikroba coliform.

-          Fungsi dari media Eosin Methylene blue agar (EMBA) iaalh sebagi indikator untuk memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang memefermentasikan laktosa dan yang tidak. Sedangkan  fungsi dari media brilliant green laktose bile borth (BGLBB) ialah sebagai pengkonfirmasi hasil tes positif uji penduga. Dan media lactose borth (LB) berfungsi sebagai media untuk mendeteksi keberadaan bakteri coliform dalam air.

-          Proses terjadinya gelembung pada tabung durham terjadi karena adanya fermentasi laktosa yang di lakukan oleh bakteri golongan E.coli sehingga terbentuk asam pada media yang tedapat laktosa, yang dapat di lihat dengan kekeruhan sehingga menghsilkan gas atau gelembung dara pada tabung durham

5.2 Saran

Di harpkan prtikan harus melepas peralatan acsesoris seperti gelang dan cincin, agar tidak mengganggu saat dalm melakukan percobaan perhitungan jumlah mikroba dengan menggunakan metode MPN.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D . 1994. Dasar - Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan

Dwidjoseputro, D . 2005.  Dasar - Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan

Hastowo, Sugyo . 1992 . Mikrobiologi . Jakarta : Rajawali

Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid 1.

Bandung : CV Yrama Widya

Lay,Bibiana.W . 1992 . Analisis Mikroba Di Laboratrium . Jakarta : Rajawali

Waluyo, Iud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas Muhammadiyah

� V